돼지 난소 과립막세포 배양액으로부터 발현된 GnSIF의 활성에 관한 연구
Porcine Granulosa Cells Produce Gonadotropin Surge Inhibiting Factor (GnSIF) Activity In Vitro
서수형,
소속 상세정보
서수형 ( )
한림대학교 의과대학 강동성심병원 산부인과학교실
KMID : 0358419990420122815
Abstract
목적: 뇌하수체에서 분비되는 LH surge를 억제하는 물질의 존재에 대한 연구가 활발해 짐에 따라 돼지와 소의 난포액을 여러 차례 색층분석 하여 추출된 어떤 단백질이 배양된 쥐의 뇌하수체 전엽세포로부터 LH 분비를 억제한다는 사실이 밝혀졌고 곧 GnSIF (Gonadotropin Surge Inhibiting Factor) 또는 GnSAF (Gonadotropin Surge Attenuating Factor)로 명명되었다. 본 연구의 목적은 돼지의 난소 과립막세포에서 GnSIF를 생성하는 가를 알아보며 난포기의 각 시기에 따른 GnSIF 분비정도의 차이를 알아보기 위한 것이다.
연구방법 및 재료: 3군의 각기 다른 크기의 돼지 난포로부터 난포액을 천자 하여 얻어진 과립막세포를 Ham´s F-12/DMEM 배양액을 담은 24칸 배양판에 3배수로 한 칸당 500,000개의 살아있는 세포를 넣어 24시간 배양하였다. 세포들이 착판 된 것을 확인한 후 세포를 EBSS (Earl´s buffered saline solution)로 세척하여 2% FBS와 100ng/ml 농도의 FSH를 함유한 DMEM/F-12 배양액에 72시간 동안 배양한 후 각 군의 배양액을 수집하였다. 이 배양액들을 heparin-Sepharose로 색층분석 하여 inhibin과 follistatin의 활성을 제거한 후 쥐 뇌하수체 세포 생분석 (bioassay)을 이용하여 각 군의 GnSIF 활성을 측정하였다. 어린 암컷 Sprague-Dawley 쥐의 뇌하수체를 분리하여 20% FBS, collagenase, hyaluronidase 그리고 DNAse로 처리하여 세포를 분산시켜 24칸 배양판에 칸당 500,000개의 살아있는 세포의 농도로 M199 배양약에 72시간 배양하여 착판 시킨 후 세척한 뒤 10nM/ml 농도의 GnRH와 각 3군의 과립막세포 배양액을 첨가하여 4시간 배양 후 배양액을 수집하여 핵 면역 분석(RIA)을 통해 LH 농도를 측정하였다. 이때 GnSIF의 활성도는 GnRH에 의해 자극된 뇌하수체 세포로부터 분비되는 LH가 50% 억제되는 것을 1단위(unit)로 정의하였다.
결과: 난소 과립막세포 배양액은 GnRH에 으해 자극된 쥐의 뇌하수체 세포의 LH 분비를 대조군의 69%에서 억제하였고 (p<0.001, n=2), 이는 FSH로 과립막세포를 자극한 결과 dose dependent manner로 자극되었다. 직경 1-3㎜ 의 난포로부터 수집된 초기 난포기의 과립막세포의 배양액이 직경 6㎜ 이상의 난포로부터 수집된 후기 난포기의 과립막세포의 배양액보다 뇌하수체 세포의 LG 분비를 더욱 억제하였다.
결론: GnSIF 활성은 돼지 난소 과립막세포 배양액에 존재하며 황체화(Iutenization)가 되기 이전의 초기 난포기의 과립막세포가 GnSIF 분비에 더욱 적극적이다. GnSIF는 inhibin 이나 follistatin과 더불어 뇌하수체의 성선자극호르몬의 분비를 조절하는 중요한 난소의 분비 물질임을 시사한다.
Objectives: It has been identified a novel protein in porcine and bovine follicular fluid termed Gonadotropin Surge Inhibiting Factor (GnSIF) which inhibits GnRH-stimulated LH secretion by pituitary cells in culture. The purpose of this study was to investigate the production of GnSIF by porcine granulosa cell in vitro.
Materials and Methods: Granulosa cells were aspirated from different size of porcine follicles (1-3mm, 3-5mm, >6mm in diameter) and cultured in 24-well plates in Ham´s F-12/DMEM at 500,000 cells/well for 24h. After plating, cells were washed and incubated in triplicate for 72h in DMEM/F-12 containing 2% FBS in the presence of 100ng/ml FSH and the media were collected. Granulosa cell-conditioned media were chromatographed on heparin-Sepharose to remove inhibin and follistatin, and assayed for GnSIF activity using a rat pituitary cell bioassay. Briefly, dispersed pituitary cells from adult female Sprague-Dawley rats were plated (500,000 cells/well) for 72h, washed, and incubated with granulosa cell-conditioned media in the presence of IOnM GnRH for 4h. The media were collected and assayed for LH by RIA. GnSIF activity is defined as the suppression of GnRH-stimulated LH secretion.
Results: Granulosa cell-conditioned media significantly inhibited GnRH-stimulated LH secretion by rat pituitary cells in vitro (69% of control, p<0.001, n=2 experiments). Preliminary data suggest that granulosa cells from small follicles (1-3mm) produce greater amounts of GnSIF than those obtained from larger follicles (>6mm).
Conclusions: GnSIF activity is produced by porcine granulosa cells in vitro. Granulosa cell production of GnSIF, along with other gonadal proteins such as inhibin, follistatin, and activin may be an. important component of the ovarian control of pituitary gonadotropin secretion.
키워드
난소 과립막세포;GnSIF;inhibin;Gonadotropin surge inhibiting factor (GnSIF);Granulosa cell
원문 및 링크아웃 정보
등재저널 정보