레트로바이러스 벡터를 이용한 인체 암세포주로의 유전자 전달 효율
Comparison of Efficiency of Infection of Human Cancer Cell Lines Via Retroviral Vector System
김연수, 이용주, 민진식, 임희경,
소속 상세정보
김연수 ( )
연세대학교 의과대학 암연구소
이용주 ( )
연세대학교 의과대학 암센터
민진식 ( )
연세대학교 의과대학 암센터
임희경 ( )
연세대학교 의과대학 암연구소
KMID : 0360319970290010001
Abstract
결론
박테리아의 lacZ 유전자와 neor marker 유전자를 coding하고 있는 레트로바
이러스 벡터 LN βZ DNA를 mouse 세포에만 효율적으로 감염하는 ecotropic 재조합 레트
로바이러스를 얻기 위해 ecotropic packaging cell line Ψ-2 세포들을 calcium phosphate
coprecipitation 방법에 의해 transfection시켜 transfection된 세포로부터 만들어져 세포 밖으
로 유출된 재조합 레트로바이러스를 포함하고 있는 배지를 얻었다. 이렇게 얻은 ecotropic
재조합 레트로바이러스 입자(LN βZ)를 가지고 amphotropic packaging cell line PA317 세
포들을 감염시킨 뒤, G418-resistant colony들이 생길 때까지 선별 배양하고, 각 colony들을
분리하여 이 중 높은 titer의 바이러스를 생산하는 세포주를 선별하기 위해, NIH/3T3 세포
를 target cell로 하여 titration을 시행하여 이 중 가장 높은 titer(1×107
cfu/ml)의 재조합 레트로바이러스 LN βZ를 생산하는 세포주(PA317/LN βZ)를 선별하였
다. 이렇게 선별된 높은 titer의 재조합 retrovirus를 생산하는 producer cell line PA317/LN
βZ로부터 복제가 가능하고 감염성이 있는 replication competent retrovirus(RCR)가 만들어
져 방출되는 지의 여부는 임상 전 실험에서 레트로바이러스 벡터시스템의 효율을 조사하는
데에도 매우 중요한 요인으로 작용한다. 그러므로 marker rescue 방법을 사용하여
PA317/LN βZ 세포로부터 RCR이 만들어지는지 조사한 결과 RCR이 만들어지지 않는다는
것을 확인할 수 있었다. 현재 사용되고 있는 레트로바이러스 벡터 시스템인 murine
leukemia virus에 의한 유전자 전달 효율(transduction efficiency)은 mouse 세포에 비해 인
체 세포에서는 일반적으로 매우 낮기 때문에 실제 환자를 대상으로 한 인상 유전자 요법에
서 매우 큰 장애가 되고 있다. 그러므로 인체 암세포에 대한 레트로바이러스의 감염효율의
조사는 암치료를 위한 유전자요법에 필수적이다. 인체 위암과 간암 세포주를 재조합
retrovirus LN βZ로 transduction 시킨 후, lacZ 유전자 발현조사에 의한 유전자 전달과 발
현 효율 조사를 위하여 105개의 암세포들을 6-well plate에 접종 후 1 ml의 retroviral stock
을 가지고 세포 감염을 실시하고 48시간 후에 X-gal염색을 시행하여 얼마나 많은 세포가
감염되어 lacZ 유전자를 발현하는가를 조사하였다. 그 결과 인체 암 세포주들은 mouse NIH
3T3 세포보다 5∼60배정도 레트로바이러스에 의한 감염효율이 낮다는 것이 관찰되었다.
#초록#
Purpose : There are several reasons why retroviruses are useful as vectors for gene
therapy. However, retroviral vectors also have some limitations. Research in
retroviral-mediated gene transfer has struggled with low titer and transduction efficiency
on certain human target cells even with the addition of polycations to enhance
transduction. Efficient in vivo gene transfer with retroviral vectors will require the
availability of large amounts of vector at titers higher than generally possible by most
current methods. Therefore, transduction efficiency of various human cell types with
retroviral vector system is very important in human gene therapy. In an effort to test
the transduction efficiency of a retroviral vector in the human cancer cell lines, a
retroviral vector was infected into various human cancer cell lines.
Materials and Methods : We generated retrovirus producing cell lines through
trans(traction or infection of amphotropic packaging cell line PA317 with ecotropic
retroviruses encoding bacterial lacZ gene. The amphotropic retrovirus vector was used to
transduce various human cancer cell lines.
Results : Of eight randomly chosen G418-resistant clones generated by transfection,
only two clone produced the vector at up to > 106 cfu/ml, while one of
five clones generated by infection yielded higher-titer virus in the absence of helper
virus, up to 1×107cfu/ml, than the transfected clones. Transduction with
supernatant derived from a PA317 producer cell line has resulted in transduction levels
from 1% to 15%, 5- to 60-fold lower than those analyzed in NIH3T3 cells.
Conclusion : These findings suggest that new improved gene transfer method into
human cancer cells using retroviruses is required for efficient in vivo cancer gene
therapy.
키워드
Cancer gene therapy; Retroviral vector; Transduction;
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