유전자 도입에 의한 C형 간염 바이러스 core 단백질의 간암 세포주 내 발현 및 core단백질의 세포 내 위치 검정
Expression and Intracellular Localization of Hepatitis C Viral Core Protein in Human Hepatoma Cell Line Transfected with Viral cDNA
김동완, 김선희,
소속 상세정보
김동완 ( )
창원대학교 식품영양학과
김선희 ( )
부산대학교 의과대학 생화학교실
KMID : 0360319970290010011
Abstract
서론
C형 간염 바이러스(hepatitis C virus: HCV)는 종래 non-4, non-B형으로 불리던 간염의
원인 바이러스로서 수혈 후 발생하는 간염의 가장 큰 원인으로 지적되어 왔다. HCV에 의한
간염은 만성화되는 비율이 높고 특히 간 경변을 거쳐 간암을 유발하는 것으로 알려져 현재
간암의 주요 원인 바이러스로 주목되고 있다. 그런데, HCV는 아직 in vitro에서 증식시킬
수 있는 배양계가 확립되어 있지 않고 환자의 혈 중에도 바이러스 입자수가 매우 적기 때문
에 HCV 연구는 바이러스의 cDNA를 이용한 분자 생물학적 연구에 집중되어 있다. HCV는
9.5kb의 +쇄 RNA를 핵산으로 하며 이것으로부터 큰 polyprotein이 합성된 후 세포내에서
절단과 수식을 받아 기능을 가진 각각의 바이러스 단백질로 변화하는 것으로 알려져 있다.
HCV 단백질 중 core 단백질은 191 아미노산으로 되어 있는 22kd의 unglycosylated protein
으로서 C-말단은 강한 소수성을 나타낸다. core 단백질은 HCV의 RNA와 결합하여
nucleocapsid를 형성하는 것으로 추측되고 있으며 core단백질의 유전자 염기배열은 HCV
type들간에 높은 상동성을 나타내고 있다. 또한 core 단백질은 환자에서 빠른 항체 유도를
보여 진단에도 이용되고 있다. 최근에는 core 단백질이 세포 내 암유전자와 상호 작용하여
세포를 암화 시킬 수 있다는 보고와 core 단백질이 세포 내 유전자 발현을 변화시킨다는 보
고가 있어서 HCV에 의한 간암발생과 core 단백질과의 연관성 및 core 단백질이 간세포에
미치는 영향에 대하여 관심이 모아지고 있다. 이와 관련된 것으로 HCV는 RNA바이러스이
며 생활환이 핵을 거치지 않고, 9종류의 HCV단백질도 세포질에만 존재한다는 견해와 core
단백질이 핵을 경유하며 간암발생의 중요한 원인일 것이라는 견해가 동시에 제기 되어 있는
실정이다. 이러한 관점에서 HCV의 core단백질을 자연계의 숙주인 사람의 간세포에 발현시
키고, core 단백질을 지속적으로 생산하는 stable expression cell clone을 분리하여 단시간
발현과 장시간 발현 시의 core 단백질의 세포 내 존재 위치를 확인하는 것은 core 단백질과
간암발생과의 연관성 연구뿐 아니라 사람의 간세포로부터 core 단백질의 대량 생산 및 이용
에도 크게 기여할 것으로 본다. 그러나 사람의 간세포는 외래유전자를 도입하여 지속적 발
현을 하는 세포주의 분리가 매우 어려운 것으로 알려져 있으며, 특히 약제내성 유전자를 이
용한 사람의 간세포 colony의 형성은 그 효율이 매우 낮은 것으로 알려져 있고 이것은 지금
까지 사람의 간세포를 이용한 분자생물학적 연구에 큰 장애요인으로 되어 왔다. 본 연구에
서는 core단백질의 지속 발현 세포주 분리를 위한 선택 marker로서 본 연구자에 의해 개발
된 pEF321-neo plasmid를 이용함으로써 core 단백질을 지속적으로 발현하는 human
hepatoblastoma cell line을 손쉽게, 다수 분리하였으며 이로부터 core단백질의 세포 내 존재
위치를 확인하였다.
#초록#
Purpose : Establishment of the human liver cell lines which permanently express the
HCV proteins is important for the large scale production of viral antigen and analysis of
the mechanism of hepatocellular carcinogenesis by HCV. Here, we attempted to establish
the human hepatoblastoma cell lines which stably express the HCV core protein and
examined the intracellular localization of the core protein.
Materials and Methods : The cDNA of HCV core protein and neomycin resistance
gene were expressed in HepG2 cells by the SR α promoter and human EF-1 α gene
promoter, respectively The core protein was detected by immunofluorescence assay and
western blotting.
Results : We obtained several HepG2 cell clones which express HCV core protein
stably. In transient expression assay, the core protein was localized in the cytoplasm in
about 90%, and localized in the nucleus in about 10% of the core-expressing HepG2
cells. But, in the stably expressing HepG2 cell clones, the core protein was localized
only in the cytoplasm. No HepG2 cell containing core protein in the nucleus was found
in all of the cells which stably express the core protein.
Conclusion : The EF-1 α gene promoter is highly efficient in the colony formation by
neomycin resistance gene and is very useful for the isolation of human liver cell clones
which express foreign genes stably. HCV core protein is localized in both nuclear and
cytoplasm of human liver cell in short term but the cells containing the core protein in
nucleus seem to disappear in long term culture.
키워드
HCV core protein; Human hepatoblastoma cell line; Stable expression; Protein localization;
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