폐쇄형 c-myb Antisense Oligonucleotides 개발과 암세포의 성장억제 연구
Development of Covalently Closed c-myb Antisense Oligonucleotides for Growth Inhibition of Leukemic Cells
대한암학회지 1999년 31권 2호 p.348 ~ 359
문익재, 박종구,
소속 상세정보
문익재 ( )
계명대학교 의과대학 생화학교실
박종구 ( )
계명대학교 동산의료원 의과학연구소
KMID : 0360319990310020348
Abstract
서론
Antisense oligodeoxynucleotides (AS-oligos)를 이용한 유전자의 염기배열 특이적인 발현
억제는 유전자 기능 연구에 유용한 도구로 사용되어 왔으며, 암과 같은 질병의 분자 치료제
개발 연구에도 이용되어 왔다. Antisense 연구에 사용되는 짧은 길이의 합성 oligos는
Watson-Crick base pairing으로 목적 mRNA에 결합되도록 디자인된 것이다. AS-oligos는
특이적으로 유전자의 발현을 억제할 수 있고 목표 설정과 제작이 용이한 장점이 있다. 이러
한 장점을 이용하여 발암 유전자의 표현 억제와 더불어 암세포 성장 억제에 관한 여러 연구
가 시도되어 왔다. AS-oligos에 의한 유전자 발현의 저해는 상보적인 myNA 염기 배열에
결합하여 RNase H활성을 유도함으로써 mRNA를 제거하거나 혹은 단백질 번역을 위한
ribosomal complex의 형성 및 진행을 방해함으로써 이루어진다. 또한 genomic DNA를 목표
로 한 As-oligos는 triple-helix 구조를 형성하여 유전자의 전사를 억제한다.
AS-oligos를 활용하기 위해서는 몇 가지 개선되어야 할 문제점이 있는데 이는 nucleases
에 대한 안정성 향상, 목적 염기 배열에 특이적인 결합 및 목표 조직과 세포내의 효율적 전
달 등이다. Phosphodiester (PO)-oligo는 nucleases에 매우 불안정하기 때문에
phosphorothioate (PS)-oligo, methylphosphonate (MP)-oligo, C-5 propane pyrimidine
oligo 그리고 N3'→P5'phosphoramidates등 다수의 변형된 oligo 유사체들이 연구되어 왔다.
그러나 이들은 경우에 따라 목적 핵산 염기 배열에 대한 특이성 및 RNase H 활성에서 문
제점을 나타내고 있다. AS-oligos의 세포 내 효율적 전달을 위해서는 liposomes, folic
acid-polylysine carrier, electroporation 등 여러 가지 방법이 사용되었다. 근년에는 cationic
liposomes을 이용한 전달 방법이 사용상의 간편함과 상대적으로 높은 세포 내 전달 효율성
으로 빈번히 사용되고 있다. Cationic liposomes의 사용으로 nucleases에 대한 AS-oligo의
안정성 및 세포 내 전달은 상당히 개선되었지만, cationic liposomes은 자체의 독성에 따른
사용량의 한계가 있으며, 전달 효율면에서 아직도 많은 개선을 필요로 한다.
Proto-oncogene c-myb은 조혈 세포(hematopoietic cell)에서 세포 증식과 분화 과정을 조
절하는 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 보고되었다. 정상적인 조혈 세포에서 c-myb
단백질은 분화 단계에 따라서 양적인 변화가 있으며 최종 분화 상태의 조혈 세포에서는 매
우 적은 양의 c-myb 단백질이 발현된다. 그러나 혈액암 세포에서는 빈번히 c-myb이 비정
상 또는 과발현(overexpression)되고 있다. HL-60 (promyelocytic cancer cell line)와 K562
(CML, chronic myelogenous leukemia) 암 세포주를 대상으로 c-myb mRNA를 감소시켰을
때 세포의 증식이 저해되거나 apoptosis로 진행된다고 보고되고 있다. 그러나 현재까지 사용
된 As-oligos는 antisense 효과가 항암제로 개발되기에는 충분치 못한 점이 있었다.
mRNA의 2차 및 3차 구조가 AS-oligos의 접근성에 중요한 영향을 미쳐서 2차 구조가 적
은 부분이 많은 부분보다 AS-oligos의 목표로서 훨씬 유리함이 보고되었다. 따라서 mRNA
에서 2차 구조가 적은 영역을 AS-oligos의 목표 지점으로 선정하기 위해 본 연구팀이 기존
에 개발한 바 있는 체계적인 mRNA 2차 구조 분석 방법을 사용하였다. 사용한 선상
AS-oligos중 mRNA 제거 효과가 상대적으로 우수한 것으로 판단된 4개의 antisense 염기
배열을 선택한 후 nucleases에 매우 저항성이 높은 새로운 구조의 폐쇄형
(covalently-closed) 분자로 제작하였다. 폐쇄형 구조의 As-oligos 제작은 생체내의 nuclease
활성이 대부분 exonuclease에 기인한 것을 이용하고자 했다. 본 연구에서는 cationic
liposomes을 운반체로 하여, c-myb mRNA에 대해 새로운 구조의 폐쇄형 AS-oligos를 사
용 혈액암 세포에서 암세포 성장 억제 효과를 검증하였다.
Purpose : Aberrant expression of the c-myb gene is often detected in transformed
leukemic cells. Inhibition of c-myb expression by antisense oligos could be an effective
way to abort rapid growth of leukemic cells. Developing stable antisense oligos
combined with enhanced delivery into cells would be of great use in developing an
effective anti-cancer molecular agent.
Materials and Methods : Selection of target sites was carried out by employing
computer simulation of mRNA secondary structures. Multiple antisense oligo sequences
were adjoined and AS-oligos were then covalently closed to evade exonuclease
activities. C-myb antisense oligos with a novel structure were complexed with cationic
liposomes and used to treat HL-60 leukemic cells.
Results : We developed covalently closed antisense oligos which harbor four adjoined
antisense sequences. The c-myb antisense oligos were found to be exceptionally stable
and effective in specifically ablating c-myb mRNA. The antisense oligos were able to
inhibit growth of leukemic cell line (HL-60) by about 80%. Antisense effect was more
pronounced when the cells were treated twice with the antisense oligos at lower
concentrations.
Conclusions : The novel covalently closed antisense oligo (CMAS-oligos) was found
to be effective and exceptionally stable Growth of HL-60 was significantly inhibited,
showing a rational way to develop an effective molecular anti-cancer agent.
키워드
Leukemic cells; Antisense oligos; c-myb;
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