v-Src 과발현과 관련된 세포주기인자의 변화
Characterization of the Alteration of Cell Cycle Parameters Associated with v-Src Overexpression
대한암학회지 1999년 31권 2호 p.418 ~ 428
곽상준, 백창원, 김명희,
소속 상세정보
곽상준 ( )
단국대학교 의과대학 생화학교실
백창원 ( )
강원대학교 의과대학 생화학교실
김명희 ( )
단국대학교 의과대학 생화학교실
KMID : 0360319990310020418
Abstract
목적 : 활성형 암유전자인 v-src을 발현하는 세포주를 확립하여 부유상태에서 의 성장능
력을 포함하는 변형된 세포의 성질을 확인하고 세포증식능력과 세포주기의 특성 및 조절인
자의 변화를 대조 세포군과 비교, 동정하여 이와 관련된 신호전달경로에 대한 이해를 높이
고자 하였다.
재료 및 방법 : Swiss 3T3 세포주에 calcium phosphate의 방법으로 v-src유전자를 이입
하고 western blotting, phosphotyrosine blotting 및 soft agar assay로 적합한 세포주군을
선택하여 세포성장속도를 측정하였다. Flow cytometry와 BrdU incorporation assay로 세포
주기내의 각 단계에 세포가 분포하는 양상 및 진행속도를 비교하여 보았다. 한편 부유성장
계에서 배양된 세포들의 성장정도, 세포주기 진행상황과 더불어 세포주기 관련 단백질의 발
현 양상을 immunoblotting으로 동정하였다.
결과 : 획득된 3T3/v-src 세포주는 세포내 단백질의 tyrosine잔기의 인산화정도 및 부유
상태에서 성장하는 능력의 관점에서 다른 연구자 등의 보고와 동일하였다. 측정한 세 개의
독립된 세포주 모두에서 대조군보다 population doubling time이 짧아졌으며
G1 세포주기 단계(2n)에 분포하는 분획은 감소하고 G2/M 분획
(4n)이 증가하는 경향을 보였다. Dual staining flow cytomerty를 통하여 대조군과
373/v-src모두에서 G0/G1에 위치하는 대부분의 세포가 휴지상
태(G0)가 아님을 알 수 있었다. 부유상태의 대조군에서 소멸된 cyclic A가
373/v-src에서는 회복되었고 cyclin E의 발현도 증가하였다.
결론 : Swiss 3T3에서 v-Src단백질의 발현은 세포주기 및 성장에 관한 지표에 영향을 미
치는 것을 알게 되었으며 이 단백질의 과발현으로 부유성장능을 획득하는데 cyclin A가 참
여하는 가능성을 알게되었다.
Src family proteins have been shown to mediate numerous signals coming from
growth factors, cytokines and extracellular matrix. Its prototype, c-Src has wide tissue
distribution and serried as a main object in the study of modular structures regarding
protein-protein interaction. Oncogenic version of this kinase, v-Src, when expressed in
cultured cells, induces pleotropic responses including alteration in cell morphology, loss
of contact inhibition and anchorage-independent growth. In causing most of altered
phenomena, kinase activity seems to be required and pivotal mechanism for this
regulation was revealed that c-terminal tyrosine intramolecularly interact with its own
SH2 domain though other parts such as SH3 are also believed to contribute to some
degree.
In 1984, microinjected v-Src was reported to accelerate meiotic maturation of Xenopus
oocytes where MAP kinase seemed to be involved, providing first direct clue to the
relevance of this kinase in cell cycle progression. Also in somatic cells, its enzymatic
activity was observed to increase several fold during mitotic phase and furthermore this
increase in activity correlates well with phosphorylation at several serine and threonine
residues in the N-terminal of Src by Cdc2 which is a critical player in
G2/M transition. One of its SH3 binding proteins, Sam68 was cloned,
known to be phosphorylated in phase-specific manner and speculated as a cell cycle
effector with KH domain which can bind to either RNA or single-stranded DNA. When
Src, Yes and Fyn were blocked in cells with common antibody raised against of
C-terminus of them, cell cycle progression was arrested prior to nuclear membrane
disruption, confirming their involvement in G2/M transition and functional
redundancy among familial proteins. On the other hand, Src family kinases appear to be
required for induction of DNA synthesis by several growth factor receptors or G-protein
coupled receptors, suggesting their roles in G1 phase. In case of PDGF-β
pathway, Src relays received signal far down to Myc though intervening steps are still
unclear while other signal molecules such as Shc and Stat seem to be recruited along
with Src, delivering proliferating signals under different situations. Taken together, Src
appears to participate at multiple points of cell cycle though locating far upstream in
signal paths.
In this study, we established cell lines expressing v-Src where alteration of cell
proliferating parameters were measured, particularly focusing on late G1 phase.
키워드
세포주기; v-Src; 부착비의존성; Cyclin A;
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