Bcl-2 발현 억제에 의한 암세포의 세포사 유도
Induction of Apoptosis of Cancer Cells by Inhibition of Bcl-2 Expression
대한암학회지 1999년 31권 4호 p.716 ~ 727
소속 상세정보
이호근
한명희/조수철/김정수/황평한/이호근/한명희/조수철/김정수
KMID : 0360319990310040716
Abstract
서론
Apoptosis (programmed ceil death: PCD)를 억제하는 Bcl-2 유전자는 B 세포 백혈병과
여포형 림프종에도 자주 보이는 t(14;18) 염색체 전좌를 연구하던 중 발견되었다. Bcl-2 유
전자는 염색체 18q21의 정상적인 위치에서 immunoglobulin heavy chain의 영역인 14q32로
전좌되며, 이 영역에서는 immunoglobulin heavy chain 내의 강력한 전사인자의 영향으로
Bcl-2의 과잉발현이 진행되어 여포형 림프종이 형성된다. 이후 Bcl-2는 암의 발생에 관련을
갖는 발암성 단백질(oncogenic protein)로 인식되었고, Bcl-2의 apoptosis를 억제하는 기능에
대한 생화학적인 연구가 행하여져 왔다.
조직에서 Bcl-2의 발현은 매우 다양하게 나타나며, 이는 조직, 조직내의 세포의 종류 및
세포의 분화과정에 따라 발현량이 다르게 변화한다. 상피간세포나 long lived lymphocytes
에서는 Bcl-2의 발현량이 높고, 이들 세포의 분화 후에는 발현량이 줄어들어 Bcl-2가 정상
조직에서 apoptosis를 조절하는 것으로 해석된다. 그러나, 각종 암 조직에서는 Bcl-2의 이상
혹은 과잉 발현이 나타나는데 colorectal cancer의 90%, 위암의 60%, 전립선암의 50%,
non-small cell lung cancer의 20%, 신경모세포종의 30%, 흑색종과 급,만성 백혈병에서
90% 이상으로 아주 높은 발현을 하고 있어, Bcl-2가 이들 암의 발생에 관련하는 것으로 알
려져 있다. 앞에서 언급된 암 조직에서 Bcl-2는 전좌와 같은 유전자의 구조적인 변화가 아
니며, Bcl-2의 발현에 영향을 미치는 cis- 와 trans-acting factor의 변화라고 할 수 있다.
Bcl-2의 cia-acting factor로는 v-rel, myb과 fusion protein으로 E2A-PBX1, AMLl/ETO 등
을 예로 들 수 있으며, 이들은 모두 발암성 단백질로서 세포의 형질전환에 관여한다.
Bcl-2 단백질은 homologue domain이 라고 할 수 있는 BH1, BH2, BH3, BH4를 갖고 있
으며, 이런 homologue domain의 염기서열을 함유하고 있는 단백질군을 Bcl-2 family라고
한다. Bcl-2의 관련 단백질은 세포와 조직에서 apoptosis를 조절하는 것이 특징이며, Bcl-2
처럼 apoptosis를 억제하는 단백질로는 Bcl-XL, Bcl-w, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1
등이 있으며, 반면 apoptosis를 유도하는 단백질로는 Bax, Bak, Bcl-Xs, Bad,
Bid, Bik, Hrk 등이 보고되고 있다. 세포내의 Bcl-2의 존재 부위는 사립체 외막, 핵막과 내
형질세망막에 존재하며 transmembrane (TM) 부위가 막에 삽입되는 부분이 다. Bcl-2 작용
기전은 BH4 domain에 결합하는 단백질과 결합 단백질에 의한 variable region의 인산화에
의해서 제어되며, 이의 인산화는 다른 Bcl-2 related protein의 BH3 domain에 결합을 유도
하게 된다. Apoptosis를 억제하는 Bcl-2 군은 BH4를 갖고 있는 것이 특징이며, apoptosis의
진행 과정에 활성화되는 Ced 4 효소는 BH4 domain에 결합되어 유리가 되지 않으므로
apoptosis를 억제하는 역할을 하게된다.
Bcl-2가 과잉 발현되고 있는 암세포에서는 종양억제유전자인 p53의 발현이 저하되고, 전
체의 절반에서 p53 기능이 나타나지 않는 것으로 보아 p53의 발현은 Bcl-2의 기능과 관련
이 있는 것으로 보고되고 있다. 실험적으로 p53의 기능을 회복시키면 Bcl-2의 발현이 저하
되고, 이어서 apoptosis가 진행된다. p53은 직접 혹은 간접적으로 Bcl-2의 유전자 발현에 관
련하며, 암의 발생에 있어서 p53의 기능의 저하는 Bcl-2의 발현을 유도하게 되어 암이 진행
할 수 있게 된다.
Ewing family tumor는 주로 소아에서 발병하는 뼈와 연부 조직 계의 악성 종양으로
Ewing 육종과 PNET (primitive neuroectodermal tumor)가 있다. Ewing family tumor의 약
80%에서 유전자의 전좌가 보고되고 있으며, 염색체 11번에 위치한 Fli-1 유전자와 염색체
22번에 위치한 EWS 유전자와의 융합단백이 전체 유전자 전좌의 90%를 차지한다. Fli-1은
ETS family의 전사인자에 속하며, EWS유전자는 잘 밝혀져 있지는 않지만 RNA 결합 부분
을 갖고 있다. 이 융합단백질인 EWS-Fli-1[t(11;22)]은 아미노 말단에 EWS 유전자와 카르
복실 말단에 Fli-1 유전자가 융합되어 있으며, 정상세포에서 형질전환을 하는 dominant
oncogene이다. 대부분의 Ewing 육종은 진단 가능 시에 이미 미세전이가 진행되어 방사선
치료나 국소수술 등의 적극적인 치료에도 불구하고 10% 이하의 완치율을 보이는 악성 종양
에 속한다. 최근에는 혈액내 잔존 암세포로부터 융합단백에 대한 RT-PCR을 이용한 조기진
단이 가능하여 졌다. ETS oncogene은 1997년 E26 avian erythroblastosis virus에서 myb과
융합 발현됨이 최초로 보고되었다. Ewing 육종에서 융합 발현되고 있는 Fli-1 유전자는 85
개의 잘 보관된 아미노산을 함유한 ETS family의 전사조절인자의 하나이며, 이 인자가 결
합하는 DNA의 영역은 purine이 많이 연결된 GGAA/T이다. RNA 결합 단백질인 EWS 유
전자와 Fli-1과의 융합은 정상적인 ETS domain의 전사조절이 아닌 비정상적인 전사조절이
진행되어 발암이 될 것으로 사료된다. Ewing 육종 세포에 융합단백 EWS-Fli-1의 발현을
억제시키면 apoptosis가 유도되며, 이는 융합단백질이 apoptosis의 제어에 관련을 갖는 단백
질로서 직접 혹은 간접적으로 전사에 관여함을 의미한다. 그러나, 현재까지는 융합단백과
apoptosis를 제어하는 Bcl-2 family와의 연구보고는 없으며, 또한 Ewing 육종에 대한 Bcl-2
의 과잉발현 등에 관한 보고는 없다.
본 연구에서는 EWS-Fli-1의 융합단백질이 발현되고 있는 Ewing 육종 세포주(TC135)에
서 Bcl-2의 발현을 조사하고, 이 세포에 Bcl-2의 발현을 억제시킨 후 나타나는 세포의
apoptosis를 검토하여, 난치의 암으로 알려진 Ewing 육종의 분자생물학적인 치료의 가능성
을 알아보고자 하였다.
#초록#
Purpose : High levels and aberrant patterns of Bcl-2 gene expression have been
reported in a variety of human cancers, including prostate, colorectal, lung and gastric
cancers, neuroblastoma, non-Hodgkin's lymphoma, and both acute and chronic leukemia.
The Ewing's sarcoma is a common malignant bone tumor in children and adolescents.
Nearly all Ewing's sarcomas have a t(11;22) chromosomal translocations which involves
EWS gene and Fli-1 of ETS family transcription factors. The patterns of Bcl-2 gene
expression in Ewing's sarcoma is less well known. The inhibition of Bcl-2 gene
expression leads to increase a apoptosis in several cancer cells. This study was
undertaken to characterize the patterns of Bcl-2 gene expression in Ewing's sarcoma
cell (TC135) expressing fusion protein, EWS-Fli-1, and to induce the apoptosis of
Ewing's sarcoma cell by targeting Bcl-2 gene expression using antisense strategy.
Materials and Methods : We used two types of antisense EWS-Fli-1 and Bcl-2
expression vectors. These vectors were transfected to TC135 cells by calcium phosphate
method, and transformed cells were selected using G418. The transformed cells were
stimulated with apoptosis-inducing reagents, and changes of Bcl-2 expression were
analyzed by Western and Northern blot analyses. To confirm the increased apoptosis,
we checked DNA fragmentation, cell viability assay by MTT and ICE (interleukin
converting enzyme) activity.
Results : The TC135 cells transfected with antisense EWS-Fli-1 expression vector
showed negatively regulated Bcl-2 protein and mRNA expression, but those transfected
with control vector (pcDNA3) revealed no change of Bcl-2 gene expression. These
results strong1y suggested that the EWS-Fli-1 fusion protein directly regulate Bcl-2
gene expression on the Bcl-2 gene promotor region. And the TC135 cells transfected
with antisense Bcl-2 expression vector showed increased apoptosis. These results
suggested that the apoptosis pathway of Ewing's sarcoma is regulated by EWS-Fli-1
fusion protein and following Bcl-2 gene. Finally, TC135 cells transfected with antisense
Bcl-2 expression vector did not form colonies in soft agar, which may infer the loss of
tumorigenicity
Conclusion : The targeting of Bcl-2 gene in the TC135 cells using antisense strategy
lead to an increased apoptosis in Ewing's sarcoma cells. This approach can be
considered as an efficient candidate strategy of cancer gene therapy.
키워드
Bcl-2; Fusion protein; Ewing's sarcoma; Apoptosis; Antisense;
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