양자 자기공명분광법을 이용한 아포토시스의 분석
In Vitro Analysis of Apoptotic Cell Death Using Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
대한암학회지 1999년 31권 4호 p.739 ~ 748
소속 상세정보
신동건/Dong Gun Shin
김상경/김종기/Sang Kyung Kim/Jong Ki Kim
KMID : 0360319990310040739
Abstract
서론
정상적인 세포막이 비대칭적 구조를 가지고 있다는 데에는 많은 물리적, 화학적인 증거가
있으며 특히 인지질의 분포는 상당한 비대칭성을 보여주고 있다. 적혈구의 관찰에서 포스파
티딜콜린(phosphatidylcholine)과 스핑고미엘린(sphingoinyelin)은 세포막의 바깥쪽에 분포하
고 있고 포스파티딜에탄올라민(phosphatidylethanolamine)은 안쪽에 주로 분포하고 있으며
음전하의 인지질인 포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS)은 세포막 안쪽에 국한되어 있음
이 밝혀졌다. 아포토시스가 운발된 세포에서는 초기에 세포막의 변화를 동반하며, 즉 세포막
점도의 감소, 유동성의 증가, 막인지질의 비대칭성 소실로 정상적으로 지질 이중막의 내부막
에 제한되어 존재하는 포스파티딜세린이 세포표면으로 노출된다.
이러한 세포막의 지질 구성의 변화를 이용한 검사 방법으로 최근 항응고제로 발견된
Annexin V는 음전하를 띈 인지질 특히 PS에 선택적으로 결합하는 것이 알려져 아포토시스
가 유발된 세포의 조기 표식자로 그 이용이 증가되고있다.
양자 자기공명분광법(Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy,
1H-NMR spectroscopy)은 각각의 양성자들이 어떤 분자에 결합하는가에 따
라 주변의 화학적 자기적 영향을 받아 공명주파수(resonant frequency)가 변하게 되는 화학
적 이동(chemical shift) 현상을 그 원리로 하고 있으며 자기공명주파수들의 미세한 차이로
말미암아 분석 화학적으로 각각의 원소성분을 구별할 수 있고 분자구조를 결정할 수 있는
방법으로 in vivo 혹은 in vitro에서 조직내의 대사물(metabolite)의 변화를 측정할 수 있다.
또한 신호 검출을 위해서는 적정한 분자 운동이 필요하므로 아포토시스가 유발된 세포와 같
이 세포막의 지질 구성의 변화로 인한 세포막의 유동성이 증가되어 있는 경우 지질의 변화
를 확인하는데 유용할 것으로 생각된다.
이에 저자들은 암세포주에서 아포토시스를 유발하여 초기 세포막 변화를 양자 자기공명분
광법상의 지질 스팩트럼의 변화로 인지하고, 즉 apoptotic signal을 확인하고 기존의 아포토
시스 검사 방법인 아가로스 겔 전기영동을 이용한 DNA 분절 검사법, 유속 세포 분석기를
이용한 형광이중 염색법(annexin V and propidium iodide)의 결과와 비교하여 아포토시스
분석 방법으로서 양자 자기공명분광법의 유용성을 확인하고자 하였다.
Purposes : Cells undergoing apoptosis display profound morphologic and biochemical
changes in the nucleus and cytoplasm, loss of membrane phospholipid asymmetry,
resulting in the exposure of phosphatidylserine (PS) at the surface of the cell, membrane
blebbing, and decreased membrane microviscosity. Proton nuclear magnetic resonance
spectroscopy (1H NMR spectroscopy) is able to detect the mobile fraction
of lipids contained in the cell, and thus is sensitive to membrane fluidity modifications
related to lipid composition changes. We have used 1H NMR spectroscopy
in HL-60 cell line to detect and characterize the changes in plasma membrane lipid
associated with apoptotic cell death.
Materials and Methods : We performed amlexin-FITC and propidium iodide dual
fluorescence flow cytometry, DNA gel electrophoresis, and obtained 200 ㎒
1H NMR spectra of the HL-60 cell cultures before and at 6, 12, 18, 24, 36
and 48 hours after the addition of doxorubicin (100 ng/mL).
Results : The onset of apoptosis is accompanied by a greater than four fold increase
in signal intensity ratio of the membrane lipid methylene (-CH2) resonance (at 1.2 ppm)
to the methyl (-CH3) resonance (at 0.9 ppm). The quantitative relationship between %
apoptosis and the 1H NMR signal intensity was determined by
fluorescein-annexin Ⅴ flow cytometry, and showed that increases in the CH2/CH3
resonance signal intensity ratio paralleled the surface expression of PS as an early
marker of apoptosis (γ2=0.80, N=18 samples). The gradual decrease in the
ratio of choline resonance (at 3.2 ppm) to CH3 signal intensity after 12 hours in the
time course experiment is directly proportional to the percentage of apoptotic cells (γ
2=0.96, N=18 samples).
Conclusions : Monitoring of the CH2 and choline resonance signal intensity may
therefore be useful in detecting apoptosis. Further studies using various stimuli to
induce apoptotic cell death will be necessary to better determine the capabilities of
1H NMR spectroscopy for the detection and estimation of apoptosis if
vitro.
키워드
Apoptosis; 1H NMR spectroscopy; Membrane phospholipid; Phosphatidylserine;
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