간세포 장기 보존을 위한 적정 냉동보존에 관한 연구-Ⅱ
Cryopreservation of Rat Hepatocytes for the Use of Primary Culture
정용희, 김병호, 이병욱, 한요셉, 동석호, 김효종, 장영운, 이정일, 장린,
소속 상세정보
정용희 ( Jung Yong-Hee )
경희대학교 의과대학 내과학교실
김병호 ( Kim Byung-Ho )
경희대학교 의과대학 내과학교실
이병욱 ( Lee Byoung-Wook )
경희대학교 의과대학 내과학교실
한요셉 ( Han Yo-Seb )
경희대학교 의과대학 내과학교실
동석호 ( Dong Seok-Ho )
경희대학교 의과대학 내과학교실
김효종 ( Kim Hyo-Jong )
경희대학교 의과대학 내과학교실
장영운 ( Chang Young-Woon )
경희대학교 의과대학 내과학교실
이정일 ( Lee Joung-Il )
경희대학교 의과대학 내과학교실
장린 ( Chang Rin )
경희대학교 의과대학 내과학교실
KMID : 0614620030410010041
Abstract
목적: 세포 냉동보존시 냉동 속도가 지나치게 느리면 세포에서 물이 빠져나가 용질농도가 증가하여 손상을 받고, 너무 빠르면 세포내 얼음이 형성되어 손상받게 된다. 또한 온도를 일정하게 강하시키면 융합열이 발생하여 세포에 손상이 일어날 수 있다. 컴퓨터 프로그램을 이용한 냉동에서는 온도 변화를 감지할 수 있어 이러한 손상을 최소화할 수 있다. 본 연구에서는 간세포 냉동보존을 위하여 두가지 프로그램을 설정하여 보존효과를 비교하였고, 장기간의 보존 효과에 대해서도 알아보고자 하였다.
대상 및 방법: 200ｇ내외의 주에서 collagense 문맥관류법으로 간세포를 분리하여 냉동보존에 사용하였다. 냉동보존액의 조성은 변형 Chee 배양액에 우태아혈청 20%, 냉동손상 보호제인 DMSO는 10%(4% - >16% 2단계 첨가) 를 사용하였다. 컴퓨터를 이용한 냉동의 프로그램 Ⅰ은 전박적인 냉동속도가 분당 1.33℃였고, 융합열을 낮추기 위하여 단일 충격냉각(shock cooling)을 이용하였으며, 프로그램 Ⅱ는 분당 2℃ 속도에 2단계 충격냉각을 이용하였다. 냉동보존 1개월 및 6개월 후 세포생존율과 배양 세포부착률을 비교하였으며, 보존액내 포함되는 세포 수 및 해빙 온도에 따른 변화도 관찰하였다.
결과: 한달간 냉동보존한 후의 세포생존율은 프로그램Ⅰ에 비하여 프로그램Ⅱ가 다소 우수하였으며, 세포 농도 2×106/㎖에서 가장 우수한 결과를 보여 다른 경우 보다 10-20% 정도 높은 74.5±2.5%을 나타냈다(p<0.05). 배양 세포부착률은 50% 내외로 큰 차이는 없었으나 0.1×106/㎖ 농도에서는 다소 낮았다. 해빙 온도는 37℃에서 세포생존율은 51.6±2.2%였고, 40℃에서 60.4±0.9%로 10% 가까이 향상되었다(p=0.0199). 6개월 이상 보관하였을 때 세포생존율은 프로그램Ⅰ에서는 38.2±5.5%, 프로그램Ⅱ는 45.4±1.6%로 1개월 냉동보존에 비하여 유의하게 감소하였으나, 배양 세포부착률은 50% 내외로 크게 변하지 않았다. 결론: 프로그램Ⅱ에서 간세포 냉동보존 효과가 다소 우수하였으며, 세포 농도는 2×106/㎖에서 좋은 보존 효과를 보였다. 해빙 온도는 37℃보다 40℃에서 좋은 효과를 보였다. 그러나 최종적인 냉동보존 효과는 전반적으로 35%에 미치지 못하였으며, 장기간 보존 후에는 더욱 감소하는 것으로 나타나 보다 효과적인 냉동보존 프로그램 개발에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각하였다.
Background/Aims:The cryopreservation of primary hepatocytes could avoid unnecessary isolation of hepatocytes and supply them on demand. We compared two programs of computer-controlled freezing methods on the efficacy of hepatocyte cryopreservation.
Methods: Rat hepatocytes were cryopreserved by computer-controlled freezing methods. In program I, the overall cooling rate was 1.33℃/min and single-step shock cooling was used to reduce the latent heat of fusion. In program
II, the cooling rate of 2℃/min and two-step shock cooling were used. Two programs were compared in regard to hepatocyte viability and long-term cryopreservation and thawing temperature were also evaluated.
Results: The hepatocyte viability showed the highest value of 74.5±2.5% when cryopreserved using the program II and at 2×106/㎖ cell concentration in cryopreservation medium. The hepatocyte attachment rate on culture was similar in every occasion, more or less 50%. The hepatocyte viability was improved by 10% when thawed at 40℃, compared to the value at 37℃ in the program I. The hepatocyte viability was decreased to 38.2±5.5% in the program I and 45.4±1.6% in the program II after long-term cryopreservation.
Conclusion: The program II showed better survival of hepatocytes at 2×106/㎖ cell concentration. However, overall efficacy of hepatocyte cryopreservation was less than 35% and decreased more after long-term cryopreservation. Further studies are needed to develop a more effective program for hepatocyte cryopreservation.
키워드
간세포; 냉동보존; Computer-programmable freezing; Cryopreservation; Hepatocytes; Computer-prgrammable freezing;
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