Portein Kinase C Inhibitor (PKCI)에 의한 방사선 민감도 변화와 c-fos Proto-oncogene의 전사 조절
Effect of Protein Kinase C Inhibitor (PKCI) on Radiation Sensitivity and c-fos Transcription Activity
소속 상세정보
1/2최은경/12Eun Kyung Choi
1/2장혜숙/2이연희/2박건구/12Hyesook Chang/2Yun Hee Rhee/2Kun Koo Park
KMID : 0859319990170040299
Abstract
목적 : Ataxia-Telangiectasia(AT) 증은 여러 가지 유전적 결함을 갖는 질병으로 방사선 민감도
가 비정상적으로 상승되어 있는 것이 특징이다. AT 환자에게 공통적으로 존재하는 ATM 유전자
는 현재까지 방사선 신호전달에 관여하는 것으로 알려진 PI-3 kinase와 유사한 구조임이 알려져
ATM이 방사선 신호전달경로에 중요한 작용을 할 것으로 추정하게 되었다. 본 연구에서는 AT
세포와 정상세포에 PKCI를 과발현 시킴으로써 방사선 신호전달에 관여하는 PKC를 억제하여 이
것이 방사선 민감도에 미치는 영향을 관찰하고, 방사선에 의해 유도되는 early response gene인
c-fos transcription의 차이를 측정하여 ATM과 PKCI에 의한 신호전달이 c-fos 유전자 전사에 미
치는 영향을 분석하고자 하였다.
대상과 방법 : PKCI expression vector를 작제한 후 정상세포인 LM217과 AT세포인 AT5BIVA
에 transfection 시킨 후 plasmid의 genomic DNA에 결합된 것은 polymerase chain
reaction(PCR) 방법으로 확인하였고 PKCI의 mRNA 발현 여부는 northern blotting으로 확인하였
다. 방사선 민감도는 아포토시스로 측정하였으며 PKCI가 과발현된 각 세포주에 5 Gy의 방사선을
조사한 후 48시간에 세포를 모아 TUNEL방법으로 아포토시스 세포의 수를 측정하였다. c-fos 유
전자의 전사는 reporter 유전자로 c-fos CAT plsmid를 β-gal expression vector와 같이 각 세포
주에 transfection 시키고 36시간이 지난 후 CAT assay를 하여 activity를 측정하고 동시에 β
-gal assay를 시행하여 transfection 효율을 보정해 주었다. PKCI, Ras의 영향을 보기 위하여는
PKCI, Ras expression vector와 c-fos CAT plasmid를 contransfection하고 CAT activity로 측정
하였다.
결과 : 이 실험의 결과 LM과 AT 세포에서 PKCI가 방사선 민감도에 미치는 영향과 c-fos 전사
에 미치는 영향을 처음으로 보여주었다. PKCI의 과발현이 LM 세포에서는 방사선 민감도를 증가
시켰지만 AT 세포에서는 오히려 약간 감소시키는 작용을 나타내었다. c-fos 전사는 AT 세포에
서 LM 세포에 비하여 70배 낮게 나타났는데 PKCI가 과발현 됨으로써 Lm에서는 C-fos의 전사
가 감소되었지만 At 세포에서는 영향이 없었다. Ras 단백으로 c-fos를 유도시키고 여기에 PKCI
발현 백터를 contransfection 하면 LM 세포에서는 induction이 감소되었지만 AT 세포에서는 영
향이 없었다. 즉 LM과 AT 세포에서의 PKCI에 의한 반응의 차이는 Ras와 관련된 signal
transduction pathway라는 것을 알 수 있었다.
결론 : PKCI는 정상세포에서는 방사선에 의한 세포 손상을 증가시키지만 AT 세포에서는 별 영
향을 보이지 않는 것을 알 수 있었으며, 두 세포간의 이러한 차이는 c-fos proto-oncogene의 전
사차이로 설명할 수 있겠다. 이러한 차이가 AT 세포의 방사선 민감도의 한 원인일 것으로 생각
된다.
Purpose : The human genetic disorder ataxia-telangiectasia (AT) is a multisystem disease
characterized by extreme radiosensitivity. The recent identification of the gene mutated in AT,
ATM, and the demonstration that it encodes a homologous domain of phosphatidylinositol
3-kinase (p13-k), the catalytic subunit of an enzyme involved in transmitting signals from the
cell surface to the nucleus, provide support for a role of this gene in signal transduction.
Although ionizing radiation was known to induce c-fos transcription, nothing is known about
how ATM or PKCI mediated signal transduction pathway modulates the c-fos gene
transcription and gene expression. Here we have studied the effect of PKCI on radiation
sensitivity and c-fos transcription in normal and AT cells.
Materials and Methods : Normal(LM217) and AT (AT5BIVA) cells were transfected with
PKCI expression plasmid and the overexpression and integration of PKCI was evaluated by
northern blotting and polymerase chain reaction, respectively. 5 Gy of radiation was exposed
to LM and AT cells transfected with PKCI expression plasmid and cell were harvested 48
hours after radiation and investigated apoptosis with TUNEL method. The c-fos transcription
activity was studied by performing CAT assay of reporter gene after transfection of c-fos
CAT plasmid into AT and LM cells.
Results : Our results demonstrate for the first time a role of PKCI on the radiation
sensitivity and c-fos expression in Lm and AT cells. PKCI increased radiation induced
apoptosis in LM cells but reduced apoptosis in AT cells. The basal c-fos transcription
activity is 70times lower in AT cells than that in LM cells. The c-fos transcrption activity
was repressed by overexpression of PKCI in LM cells but not in AT cells. After induction of
c-fos by Ras protein, overexpression of PKCI repressed c-fos transcription in LM cells but
not in AT cells.
Conclusion : Overexpression of PKCI increased radiation sensitivity and repressed c-fos
transcription in LM cells but not in AT cells. The results may be a reason of increased
radiation sensitivity of AT cells. PKCI may be involved in an ionizing radiation induced
signal tranduction pathway responsible for radiation sensitivity and c-fos transcription. The
data also provided evidence for nvel transcriptional difference between LM and AT cells.
키워드
방사선 민감도; 혈관확장성 운동실조증; PKCI; c-fos; Radiation sensitivity; Ataxia-Telangiectasia; PKCL; c-fos;
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