방사선 감수성 측정법으로 MTT 법 시행 시의 최적 조건에 대한 연구
The Optimal Condition of Performing MTT Assay for the Determination of Radiation Sensitivity
홍세미, 김일한,
소속 상세정보
홍세미 ( )
서울대학교
김일한 ( )
서울대학교 의학연구원 방사선의학연구소
KMID : 0859320010190020163
Abstract
목적: 방사선조사후 세포의 생존 분획은 세포집락 측정기법으로 확인하는 것이 표준이나 많은 비용과 시간이 소요되는 단점을 갖고 있다. 이에 생존 세포의 tetrazolium염의 자색 formazan 침전물로의 환원시키는 능력에 그 기반을 둔 MTT 기법을 사용하여 세포집락
측정기법을 대체하기 위한 기법으로서의 유용성과 그 실행상의 최적조건을 규명하고자 하였다.
방법: PCI-1, SNU-1066, NCI-H630, RKO 등의 세포주에 0, 2, 4, 6, 8, 10 Gy의 방사선을
조사한 후 세포집락 측정기법과 MTT기법으로 세포 생존 분획을 조사하였다 세포집락 측정
기법은 25 ㎠ 폴리스티렌 배양 플라스크에 방사선량에 따라 다른 수의 세포를 분주한 후 24
시간 동안 배양 후 방사선을 조사하였고 이를 10~14일 동안 배양 후 염색하여 생성된 세포
집락의 수를 측정하였다. MTT기법은 침전물의 용해과정이 필요없는 Premix WST-1 시약
을 이용하여 시행하였다. MTT기법은 각각의 세포주에서 세포수와 흡광도간의 선형관계와
최적 실험조건을 확인한 이후 시행하였다 이 기법은 방사선을 조사받은 세포에서는 지수적
성장을 회복한 이후와 방사선을 조사받지 않은 세포는 4회 이상의 세포분열을 거친 후에 시
행하였다. 세포집락 측정기법 및 MTT기법을 통하여 얻은 세포 생존율을 구한 후 이를 지
표로 비교하였다.
결과: 각 기법으로 얻은 세포 생존율의 표준편차는 5% 내외였다. 2가지 방법으로 구한 세포
생존율은 t-test로 비교하였을 때 0~4 Gy 에서는 통계적으로 유의한 차이가 없었으며 회귀
분석 결과는 선형적 관계가 있었다.(R2=0.975-0.992). MTT 기법의 시행에 최
적인 세포수는 배양효율에 따라 다른 것으로 나타났는데, 배양효율이 30% 이상 이면 300개
이하가, 30% 미만인 경우는 500~1,000개가 적당한 것으로 확인되었다. MTT기법은 6 배가
시간 경과 이후에 시행하는 것이 세포집락 측정기법과 가장 근접하였으며 적어도 4 배가시
간 이후에 시행하는 것이 필요할 것으로 사료되었다. 이에 따르면 배가시간이 3일 이하인
세포주가 세포 민감성 측정방법으로서 MTT 기법이 세포집락 측정 기법을 대체하여 사용하
기에 적합한 것으로 사료되었다.
결론: 이상에서, MTT기법을 이용하여 방사선조사 후의 세포생존을 측정하기 위해서는 예
비실험을 통해 각 세포주에서의 최적의 조건을 찾는 것이 필수적이며 이 조건하에서 MTT
기법을 시행해야만 방사선에 의한 세포 민감성 측정에 이용될 수 있음을 확인하였다.
Purpose: The measurement of radiation survival using a clonogenic assay, the established standard, can be difficult and time consuming. In this study, We have used the MTT assay, based on the reduction of a tetrazolium salt to a purple formazan
precipitate by living cells, as a substitution for clonogenic assay and have examined the optimal condition for performing this assay in determination of radiation sensitivity.
Material and Methods: Four human cancer cell lines -PCI-1, SNU-1066, NCI-H630 and
RKO cells have been used. For each cell line, a clonogenic assay and a MTT assay
using Premix WST-1 solution, which is one of the tetrazolium salts and does not
require washing or solubilization of the precipitate were carried out after irradiation of 0,
2, 4, 6, 8, 10 Gy. For clonogenic assay, cells in 25 ㎠ flasks were irradiated after
overnight incubation and the resultant colonies containing more than 50 cells were
scored after culturing the cells for 10~14 days. For MTT assay, the relationship between
absorbance and cell number, optimal seeding cell number, and optimal timing of assay
was determined. Then, MTT assay was performed when the irradiated cells had
regained exponential growth or when the non-irradiated cells had undergone four or
more doubling times.
Results: There was minimal variation in the values gained from these two methods with
the standard deviation generally less than 5%, and there were no statistically significant
difference between two methods according to t-test in low radiation dose (below 6 Gy).
The regression analyses showed high linear correlation with the R2 value
of 0.975~0.992 between data from the two different methods. The optimal cell numbers
for MTT assay were found to be dependent on plating efficiency of used cell line. Less
than 300 cells/well were appropriate for cells with high plating efficiency (more than
30%). For cells with low plating efficiency (less than 30%), 500 cells/well or more were
appropriate for assay. The optimal time for MTT assay was after 6 doubling times for
the results compatible with those of clonogenic assay, at least after 4 doubling times
was required for valid results. In consideration of practical limits of assay (12 days, in
this study) cells with doubling time more than 3 days were inappropriate for application.
Conclusion: In conclusion, it is found that MTT assay can successfully replace
clonogenic assay of tested cancer cell lines after irradiation only if MTT assay was
undertaken with optimal assay conditions that included plating efficiency of each cell line
and doubling time at least.
키워드
MTT법; 세포집락 측정기법; 방사선 감수성; Clonogenic assay; MTT assay; Radiation sensitivity;
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