이온화 방사선에 의한 TIMP1, TIMP2 유전자 발현 측정
Expression of TIMP1, TIMP2 Genes by lonizing Radiation
소속 상세정보
박건구/Kun-Koo Park
진정선/박기영/이연희/김상윤/노영주/안승도/김종훈/최은경/장혜숙/Jung Sun Jin/Ki Yong Park/Yun Hee Lee/Sang Yoon Kim/Young Ju Noh/Seung Do Ahn/Jong Hoon Kim/Eun Kyung Choi/Hyesook Chang
KMID : 0859320010190020171
Abstract
목적: Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TMP)는 matrix metalloproteinase (MMP)에 작용하여 암세포의 침윤과 전이를 억제하고 염증, angiogenesis, fibrosis에 중요한 역할을 한다. TIMP 유전자는 여러 cytokine 및 signal molecule에 의하여
조절되는
유전자이므로 방사선에 의한 TIMP의 발현을 측정하고 전사 조절 기전을 연구하고자 하였다.
대상 및 방법: 두경부암 환자의 병변에서 유도하여 확립한 두경부암 세포주를 이용하여 방
사선에 의한 TIMP 유전자 발현을 측정하였다. 각 세포주의 방사선 민감도를 측정하고
transwell을 이용한 invasion assay로 전이성을 측정하였다. TIMP1, TIMP2 발현은
conditioned medium을 취해 ELISA assay로 측정하였다. 방사선조사는 2Gy , 10Gy 군으로
나누어 관찰했고 조사 후 시간 간격은 24, 48시간이었다. MTT assay로 생존세포 수를 측
정하여 방사선 세포치사로 인한 발현 변화를 보정하였다. hTMP1 promoter region을 PCR
하여 pGL2-basic luciferase reporter vector에 cloning하여 인간 두경부암 세포주에 이입하
여 functional TIMP1 발현이 증가하는지 확인하였고 protein kinase C (PKC) activator인
PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate)와 Ras에 의한 TIMP1발현이 유도되는지 확인하였
다.
결과: HN-1, HN-2, HN-3, HN-5, HN-9 세포주의 D0는 각각 1.55 Gy, 1.8
Gy, 1.5 Gy, 1.55 Gy, 2.45Gy 이었다. 각 세포주의 방사선조사 후 MTT assay에 의한 cell
viability는 24, 48시간에서 2 Gy인 경우 모두 94% 이상 그리고 10 Gy에서는 73% 이상의
생존 세포를 확인하였다. TIMP1, TIMP2 단백의 basal 농도는 24시간 48시간에서 점점 증
가하여 세포에서 계속 합성되어 분비되고 있음을 확인하였다. 2 Gy조사 후 24시간에서
TIMP2는 HN-1, HN-9 세포주에서 감소하였으나, 10 Gy 조사 후에는 두 세포주에서 모두
증가하여 방사선량에 따라 반응이 달랐고, 방사선조사후 48시간에는 HN-1세포주에서는 증
가하나 HN-9 세포주에서는 감소하여 세포주에 따라 반응이 달랐다. 그러나 방사선에 의한
TIMP1 발현 변화는 미미하였다. TIMP1 reporter gene을 인간 두경부암 세포주에
transfection하고 PMA(100 ng/ml)을 가한 경우 HN-1세포주에서는 유의하게 증가하고
HN-9 세포주에서는 감소하였다. Ras 발현 백터와 co-transfection한 경우 TIMP1 promoter
가 활성화 되었다.
결론: 모두 두경부 암에서 유래된 세포주 이지만 방사선에 의한 TIMP의 발현 및 전사조절
기전은 세포주 마다 차이가 있었고 이온화 방사선의용량에 따라서, 방사선조사 후의 시간
경과에 따라서도 TIMP 발현에 차이가 이었다. 이 결과는 TIMP의 전사 및 발현이 여러 종
류의 signal molecule에 의하여 영향을 받고, 이 signal molecule들이 각 세포주 마다 다르
기 때문으로 사료된다.
Purpose: Expression of TIMP, intrinsic inhibitor of MMP, is regulated by signal transduction in response to genotoxins and is likely to be an important step in metastasis, angiogenesis and wound healing after ionizing radiation. Therefore, we
studied
radiation mediated TMP expression and its mechanism in head and neck cancer cell lines.
Materials and Methods: Human head and neck cancer cell lines established at Asan
Medical Center were used and radiosensitivity (D0), radiation cytotoxicity
and metastatic potential were measured by clonogenic assay, MTT assay and invasion
assay, respectively. The conditioned medium was prepared at 24 hours and 48 hours
after 2 Gy and 10 Gy irradiation and expression of TIMP protein was measured by
Elisa assay with specific antibodies against human TIMP. hTIMP1 promotor region was
cloned and TIMP1 luciferase reporter vector was constructed. The reporter vector was
transfected to AMC-HN-1 and -HN-9 cells with or without expression vector Ras, then
the cells were exposed to radiation or PMA, PKC activator. EMSA was performed with
oligonucleotide (-59/-53 element and SP1) of TIMP1 promotor.
Results: D0 of HN-1, -2, -3, -5 and -9 cell lines were 1.55 Gy, 1.8 Gy,
1.5 Gt, 1.55 Gy and 2.45 Gy respectively. MTT assay confirmed cell viability, over 94%
at 24hrs, 48hrs after 2 Gy irradiation and over 73% after 10 Gy irradiation. Elisa assay
confirmed that cells secreted TIMP1, 2 proteins continuously. After 2 Gy irradiation,
TIMP2 secretion was decreased at 24hrs in HN-1 and HN-9 cell lines but after 10 Gy
irradiation, it was increase in all cell lines. At 48hrs after irradiation, it was increased in
HN-1 but decreased in HN-9 cells. But the change in TIMP secretion by RT was mild.
The transcription of TIMP1 gene in HN-1 was induced by PMA but in HN-9 cell lines,
it was suppressed. Wild type Ras induced the TIMP-1 transcription by 20 fold and 4
fold in HN-1 and HN-9 respectively. The binding activity to -59/-53, AP1 motif was
increased by RT, but not to SP1 motif in both cell lines.
Conclusions: We observed the difference of expression and activity of TIMPs between
radiosensitive and radioresistant cell line and the different signal transduction pathway
between in these cell lines may contribute the different radiosensitivity. Further research
to investigate the radiation response and its signal pathway of TIMPs is needed
키워드
TIMP; Gene regulation; 두경부암; 방사선; TIMP; Gene regulation; Head and neck cancer; Radiation;
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